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新型光散射抑制機(jī)制助力高保真光固化生物3D打印

更新時(shí)間：2023-06-01點(diǎn)擊次數(shù)：1542
光固化生物3D打印技術(shù)（如：數(shù)字光處理帶動擴大，DLP）可精確控制細(xì)胞和生物材料在空間中的分布核心技術體系，以此構(gòu)建復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于組織工程持續發展、藥物篩選必然趨勢、外科植入物等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域促進善治。然而，在DLP打印過(guò)程中多樣性，光在固液兩相界面會(huì)產(chǎn)生物理散射發揮效力，細(xì)胞的混入會(huì)加劇此種散射效應(yīng)，導(dǎo)致水凝膠在非目標(biāo)區(qū)域固化明顯，降低了打印精度安全鏈，使眾多生物性能優(yōu)異且具有小尺度特征（如血管網(wǎng)絡(luò)和薄壁結(jié)構(gòu)等）的復(fù)雜結(jié)構(gòu)難以成型，限制了DLP打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用創新為先。針對(duì)這一挑戰(zhàn)真正做到，湖南大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院韓曉筱教授等提出了一種光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光散射抑制新機(jī)制，并基于此機(jī)制開(kāi)發(fā)了一種新型光抑制劑（Curcumin-Na持續向好，Cur-Na）習慣，降低了載細(xì)胞水凝膠光固化打印過(guò)程中的光散射效應(yīng)，將打印精度提高到1.2-2.1像素點(diǎn)進展情況，幾何誤差低于5%的積極性，成功制造了各種具有多尺度通道和薄壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生物活性功能支架。此外至關重要，該方法具有較寬的打印參數(shù)窗口不久前，極大地縮短了參數(shù)優(yōu)化過(guò)程。相關(guān)研究成果以題為"Photoinhibition via simultaneously photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting"的文章發(fā)表在《Nature Communications》（SCI一區(qū)提升行動，Top期刊能力建設，IF=17.69）。湖南大學(xué)博士研究生賀寧為第一作者研究進展，湖南大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院韓曉筱教授和陳鋒副教授為通訊作者無障礙。



水凝膠生物墨水中傳統(tǒng)的光吸收劑能夠吸收過(guò)量的光能量，防止打印層厚過(guò)厚快速融入，從而在一定程度上提高垂直方向上的打印精度善於監督。然而，傳統(tǒng)的光吸收劑難以解決由光散射引起的水平方向上過(guò)固化的問(wèn)題就能壓製。因此更合理，該研究提出了光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制機(jī)制：保留傳統(tǒng)光吸收劑功能的同時(shí)并能“搶奪"水平方向上散射光激發(fā)的自由基，抑制散射區(qū)域的自由基與水凝膠發(fā)生聚合反應(yīng)更優美，防止非目標(biāo)區(qū)域的固化各方面，從而提高水平方向上的打印精度和保真度〕尚c經驗；诖藱C(jī)制適應性，該團(tuán)隊(duì)首先成功開(kāi)發(fā)了一種新型光抑制劑（Cur-Na）（如圖1），其具有良好水溶性和生物相容性稍有不慎。接著融合，該團(tuán)隊(duì)制備了含不同光抑制劑的PEG-GelMA生物墨水深入闡釋，通過(guò)研究生物墨水的物化性質(zhì)評(píng)價(jià)了其可打印性和機(jī)械性能（如圖2）相關性。然后通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)研究聚合過(guò)程完成的事情，揭示了Cur-Na減輕散射效應(yīng)的機(jī)制（如圖3）：Cur-Na的吸收峰位于425nm附近，非常接近光源波長(zhǎng)穩定，可以作為典型的光吸收劑降低光穿透深度改造層面。同時(shí)，Cur-Na 可以通過(guò)更高的反應(yīng)速率競(jìng)爭(zhēng)性地?fù)寠Z自由基來(lái)阻止水凝膠單體聚合形成固化水凝膠優勢與挑戰。再者經驗分享，Cur-Na 的反應(yīng)產(chǎn)物為液體，避免了非目標(biāo)區(qū)域的固化趨勢。由于 Cur-Na 的高反應(yīng)性速率有力扭轉，固定濃度的 Cur-Na 可以在很寬的光強(qiáng)度范圍內(nèi)抑制散射效應(yīng)，避免在打印不同結(jié)構(gòu)的時(shí)一站式服務，打印參數(shù)再次優(yōu)化廣度和深度，提高打印效率。文章中引領作用，圖4和圖5定量研究了加入Cur-Na后的生物墨水的打印分辨率和圖案保真度加強宣傳，以驗(yàn)證Cur-Na在解決光散射效應(yīng)方面的有效性。之后用的舒心，團(tuán)隊(duì)將添加了Cur-Na的生物墨水應(yīng)用到摩方精密 microArch S140光固化打印機(jī)中技術發展，成功地制造了各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)體（仿生支架，可灌注血管網(wǎng)絡(luò)集成，極小三周期曲面等）自主研發，證明了該光抑制劑在制造具有小尺度特征的功能性載細(xì)胞三維支架方面的卓。越能力（如圖6）更加廣闊。圖7進(jìn)一步證明了此生物墨水在組織工程中的適用性損耗。


圖片圖1. 姜黃鈉的合成。a. 用姜黃素和碳酸氫鈉合成姜黃素鈉（Cur-Na）的過(guò)程不斷發展。姜黃素分子中酚羥基的H+被Na+取代（紅色橢圓）積極影響，而姜黃素中的羰基鍵發(fā)生酮-烯醇互變異構(gòu)（藍(lán)色橢圓）。b. 姜黃素和Cur-Na的1H-NMR光譜緊密協作，顯示了合成過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)性質(zhì)的代表性變化越來越重要。藍(lán)色陰影區(qū)域表示酚羥基的特征共振（δ=9.65ppm）。綠色陰影是烯烴信號(hào)（δ=5.93ppm）發揮重要作用，表明C=C雙鍵的形成醒悟。

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圖2. 生物墨水的物化性質(zhì)。添加了不同濃度光抑制劑的生物墨水（PEG-GelMA/LAP）的儲(chǔ)能模量（G'反映材料的剛度）和損失模量（G''反映材料粘度）隨時(shí)間的變化：a.檸檬黃和b. Cur-Na高質量。G'和G'之間的交叉點(diǎn)被稱(chēng)為凝膠點(diǎn)也逐步提升，而凝膠時(shí)間被定義為曝光開(kāi)始至凝膠點(diǎn)的時(shí)間（在該研究中約為20秒）記得牢。生物墨水在405nm、13mW cm?2的光照下曝光30s重要的作用。陰影區(qū)域表示曝光時(shí)間更多可能性。c. 水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。d. 三種水凝膠在~20%應(yīng)變下的彈性模量足夠的實力。三種生物墨水的e. 溶脹比和f. 溶膠分?jǐn)?shù)對(duì)比緊迫性。

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圖3. Cur-Na抑制散射效應(yīng)的機(jī)制。a. 示意圖顯示了當(dāng)光穿透生物墨水時(shí)光強(qiáng)的高斯分布以及不同情況下產(chǎn)生的固化區(qū)域更適合，包括無(wú)散射高效、有散射、與細(xì)胞混合的生物墨水和添加Cur-Na的生物墨水要素配置改革。Cd和Cw分別是固化深度和固化寬度體系。E0表示生物墨水表面的光強(qiáng)度，而EC是引發(fā)聚合所需的臨界能量帶動產業發展。b. Cur-Na自由基鏈生長(zhǎng)聚合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程由三個(gè)階段控制：（1）引發(fā)責任製、（2）鏈傳播、（3）（4）終止必然趨勢。ki促進善治，kp，ktc和ktd分別是四種反應(yīng)中的速率常數(shù)發展的關鍵。每個(gè)Cur-Na與三個(gè)自由基（R·）反應(yīng)道路，引發(fā)聚合物鏈生長(zhǎng)，形成單體（M）真諦所在。激活后的單體可以與其他單體反應(yīng)指導，聚合物鏈通過(guò)傳播而增長(zhǎng)，形成Mn·和Mm·充分。當(dāng)鏈傳播通過(guò)終止反應(yīng)終止時(shí)進一步完善，形成聚合物（Mn和Mm）。c. Cur-Na和PEGDA聚合過(guò)程中官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化率與時(shí)間的關(guān)系競爭力。散射區(qū)域的自由基可以被Cur-Na快速消耗調整推進；水凝膠單體由于缺乏自由基而難以在散射區(qū)域形成聚合物。

 

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圖4. 水平方向打印精度分析機製性梗阻。a. 輻條狀圖案用于評(píng)估打印精度機製，從中心到外圍相鄰輻條之間的間隙增加。打印精度被定義為模糊區(qū)域直徑（紅色虛線圓圈）與輻條狀圖案直徑的比值集成應用。b. 載細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光染色圖探討。c. 打印結(jié)構(gòu)的顯微圖像，顯示了純PEG-GelMA生物墨水（上）和添加了檸檬黃（中）和Cur-Na的生物墨水（下）的模糊區(qū)域（紅色虛線圓圈）大小與相對(duì)曝光能量的關(guān)系。Er指相對(duì)能量調解製度，定義為實(shí)際光能與單位曝光量的比精準調控。d. 模糊區(qū)域大小與曝光能量的定量關(guān)系。e. Cur-Na的高精度打印窗口應用的因素之一，灰色解決、紅色、藍(lán)色區(qū)域分別代表含1mM善於監督、2mM集成技術、3mM Cur-Na生物墨水的打印窗口寬度。f. 載細(xì)胞打印結(jié)構(gòu)的模糊區(qū)域大小與曝光能量之間的定量關(guān)系更合理。


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圖5. 多層打印中的中空通道打印性分析與評(píng)定高保真度的打印誤差分析。a. 具有不同直徑（D=300更優美、500和700μm）通道的圓柱體的3D CAD設(shè)計(jì)各方面。H表示圓柱體的高度，而h1成效與經驗、h2和h3是通道的中空部分適應性。打印精度定義為中空部分與通道總長(zhǎng)度之間的比率。b. 連續(xù)層打印中的散射效應(yīng)及其引起的過(guò)固化現(xiàn)象便利性。c-e. 打印精度隨圓柱體直徑的高度和通道直徑的關(guān)系方法。f. 具有不同直徑的多通道結(jié)構(gòu)CAD設(shè)計(jì)。g. 分別使用含Cur-Na和檸檬黃的生物墨水打印的樣品提供有力支撐。h. 通道的實(shí)際直徑與設(shè)計(jì)直徑間的差異切實把製度。

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圖6. Cur-Na在打印生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中常用的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)時(shí)的分辨率和高保真度。a. 脊髓支架自行開發。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)呈現(xiàn)不規(guī)則的通道和薄壁網(wǎng)絡(luò)進行部署，模仿脊髓的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。使用兩種類(lèi)型的水凝膠成功地制備了支架：PEG-GelMA（10%）和甲基丙烯酸縮水甘油酯改性的絲素蛋白（Sil-MA（15%））應用情況。b. 具有多個(gè)分支保護好、可灌注通道（200-800μm）和薄壁（~100μm）的血管網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)注射有色染料溶液進(jìn)行灌注表現。c. 具有獨(dú)特點。特拓?fù)涮卣鳎ㄇ妗⒏呖紫堵屎瓦B通性）的gyroid支架結論。d. 打印載HepG2細(xì)胞的gyroid支架并培養(yǎng)14天和諧共生，展現(xiàn)了良好的細(xì)胞增殖效果。


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圖7. 基于PC-12細(xì)胞體外培養(yǎng)的Cur-Na 細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)智能化。a. 細(xì)胞活死染色熒光圖展示了細(xì)胞14天的活力（綠色：活細(xì)胞科技實力；紅色：死細(xì)胞）。b. CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞在支架中增殖14天在此基礎上，PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠中的細(xì)胞展現(xiàn)出最助力各行。。好的增殖效果自主研發。c. 使用PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠制造的通道支架（直徑200μm）的熒光圖像顯示了均勻的細(xì)胞分布確定性。最后一張圖像顯示了細(xì)胞沿著通道的生長(zhǎng)情況。d. 第1損耗、7和14天脊髓支架中通道的共聚焦圖像講故事。e. 熒光圖像顯示種植在PEG-GelMA/Cur-Na支架表面的PC-12細(xì)胞的分化和突起形成（第7天）。Tuj-1：Beta3-微管蛋白性能穩定；DAPI：4’全面革新，6-二胺基-2苯基吲哚。


結(jié)論



該研究提出了一種光吸收和自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制新機(jī)制研學體驗，有效抑制光輔助3D打印中的光散射效應(yīng)建設項目。基于此機(jī)制落實落細，開(kāi)發(fā)了一種新的光抑制劑（Cur-Na）相結合，具有以下獨(dú)。特優(yōu)勢(shì)：（1）顯著提高打印分辨率和保真度：在限制水凝膠的溶脹下製高點項目，打印精度可接近打印機(jī)理論極限（~1像素）為產業發展；（2）具有良好打印參數(shù)適應(yīng)性，極大簡(jiǎn)化了打印參數(shù)優(yōu)化過(guò)程有所增加；（3）在制造具有微尺度通道和薄壁等復(fù)雜支架結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)出卓各項要求。越能力，對(duì)于支架內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和氧氣的滲透具有重要意義反應能力；（4）能成功制造對(duì)光散射效應(yīng)尤其敏感的載細(xì)胞Gyroid支架共謀發展，且在歷經(jīng)14天的培養(yǎng)后，支架內(nèi)細(xì)胞展現(xiàn)出良好的增殖態(tài)勢(shì)結構重塑。（5）此方法可應(yīng)用于其他由自由基鏈生長(zhǎng)聚合控制的可光固化墨水中（例如Sil-MA等）聽得懂。該研究提供的將多尺度特征直接賦予組織結(jié)構(gòu)的方法，對(duì)于更好地模擬天然組織微環(huán)境至關(guān)重要高質量發展。研究中確立的策略提高了生物3D打印高保真復(fù)雜結(jié)構(gòu)的可打印性和可操作性全方位，從而助力更*的組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)。