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高分辨率3D打印活性酶催化載體確定性，通過精細(xì)結(jié)構(gòu)提高連續(xù)催化反應(yīng)器合成效率

更新時間：2025-02-10點(diǎn)擊次數(shù)：766

在生物化工領(lǐng)域中更加廣闊，酶催化反應(yīng)因其高效性和對合成環(huán)境的相對寬容性而聞名，常用于合成和加工經(jīng)濟(jì)價(jià)值高且難以通過傳統(tǒng)化學(xué)合成途徑獲取的化合物講故事。然而非常完善，酶催化反應(yīng)所需的活性酶往往價(jià)格不菲，且在傳統(tǒng)合成流程中不易分離全面革新，這不僅造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)作用，還使得酶催化流程的成本控制成為一大挑戰(zhàn)。因此行業分類，學(xué)術(shù)界致力于探索將活性酶負(fù)載于催化載體的方法技術特點，通過構(gòu)建連續(xù)催化反應(yīng)器，使反應(yīng)物連續(xù)流經(jīng)并接觸載體上的活性酶發展邏輯，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)凝聚力量。這一方法避免了酶直接進(jìn)入反應(yīng)液，省去了后續(xù)的分離步驟聽得進，提高了酶的利用效率和經(jīng)濟(jì)性新的力量。但此模式亦存在加工效率不高的問題先進水平，原因是酶未直接置于體系中，與反應(yīng)物的接觸面積受限全面展示，使得合成效率不及直接在體系中分散酶的方法重要平臺。



3D打印技術(shù)的興起為生物基連續(xù)催化反應(yīng)器的制造帶來了新契機(jī)。該技術(shù)允許用戶精確制備催化載體的三維空間結(jié)構(gòu)核心技術，從而載體中的活性酶與反應(yīng)物的接觸面積應用提升，進(jìn)而提升反應(yīng)器的生產(chǎn)效率。近年來創造性，已有研究通過將活性酶催化劑固定于高分子水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的方法發展的關鍵，成功制造了有催化活性的載體結(jié)構(gòu)。然而保障性，這類結(jié)構(gòu)所面臨的一個主要挑戰(zhàn)是反應(yīng)物難以充分接觸載體內(nèi)部的活性酶：由于受限于基材的擴(kuò)散性能帶動產業發展，往往僅有表面的酶能有效地發(fā)揮催化作用，導(dǎo)致內(nèi)部酶的利用不充分十分落實。



針對這一問題倍增效應，來自諾丁漢大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)采用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術(shù)及創(chuàng)新的水凝膠配方，在保持催化酶活性的前提下設施，成功制造出精度高達(dá)10 μm的精細(xì)催化載體結(jié)構(gòu)需求。這一突破顯著增強(qiáng)了催化載體與反應(yīng)物的接觸，進(jìn)而提升了整個系統(tǒng)的催化效率組合運用。相關(guān)成果以“High resolution 3D printed biocatalytic reactor core with optimized efficiency for continuous flow synthesis"為題發(fā)表在期刊《Chemical Engineering Science》上更讓我明白了。



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該文章中的生物催化反應(yīng)器芯是利用摩方精密nanoArch® S130（精度：2 μm）3D打印設(shè)備直接打印加工而成。文中使用的光固化配方由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）積極，苯基磷酸鋰（LAP）探索，檸檬黃和β-半乳糖苷酶配置而成，能夠?qū)崿F(xiàn)最小10 μm的孔道結(jié)構(gòu)產業，并具有高保真度的最小50 μm的方形流道滿意度。相較于無流道結(jié)構(gòu)，通過PμSL技術(shù)加工的三維酶基催化劑實(shí)現(xiàn)了提升催化效率可持續，可達(dá)60%主要抓手，并且通過將靜態(tài)反應(yīng)器修改成動態(tài)連續(xù)反應(yīng)器的方式，整個動態(tài)催化系統(tǒng)的催化效率相較于靜態(tài)催化系統(tǒng)提高了240%構建。



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圖1. 生物催化活性3D打印反應(yīng)器核心創新科技，具有精確控制的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。a）用于樹脂的試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)共創輝煌。b）面投影微立體光刻（PµSL）具有重要意義。c） 甲基丙烯酸硅烷化硅基板在打印過程中與3D打印的反應(yīng)器核心共價(jià)結(jié)合，防止打印中途脫落。打印后強大的功能，硅基板可輕松從平臺上分離應用的因素之一。d）3D打印的微米級通道壁厚w和邊長p的水凝膠示意圖。酶在打印過程中被原位捕獲在納米級聚合物網(wǎng)絡(luò)中（PEGDA 700的長度為4.7 nm）預期。e）不使用硅烷化基板進(jìn)行3D打印的示例。打印過程中從構(gòu)建平臺上脫落并粘附到膜上幅度，導(dǎo)致保真度差結構。f）剛打印出的空氣中的嵌入式酶（β-半乳糖苷酶）3D打印水凝膠（2 mm立方體，p=150 µm, w=100 µm貢獻，帶有7×7個水平對齊的通道）規模最大。在硅烷化基板上打印。g）打印件從平臺分離并浸入水中統籌。h）具有優(yōu)異分辨率的高保真通道（可實(shí)現(xiàn)的最小通道尺寸為10 µm）最深厚的底氣。



實(shí)驗(yàn)表明，β-半乳糖苷酶在未固化的聚乙二醇二丙烯酸酯中暴露160分鐘后單產提升，仍能保留80±10%的活性傳遞。同時，通過測量打印件浸泡在緩沖液中上清液的活性發(fā)現(xiàn)勞動精神，β-Gal被水凝膠包裹后幾乎沒有滲出開展攻關合作，這進(jìn)一步證明了該方法的有效性。



團(tuán)隊(duì)人員在非流動條件下對含β-半乳糖苷酶的催化結(jié)構(gòu)活性進(jìn)行了初步評估預下達。以邊長為2 mm的立方體的有效手段、水平排列7×7 通道（通道寬度150μm、壁厚100 μm）的反應(yīng)器核心為例方案。分光光度法結(jié)果顯示關鍵技術，420 nm處含酶的反應(yīng)器核心產(chǎn)生的產(chǎn)物信號明顯強(qiáng)于不含酶的樣本，證明了該反應(yīng)器核心用于酶催化的可行性深入。



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圖2. 通過靜態(tài)分析確定 3D 打印反應(yīng)核心的酶活性技術研究。a）首先在無流動的小瓶中對 3D 打印反應(yīng)核心進(jìn)行分析。b ）反應(yīng)的展開示意圖深刻變革。底物ONPG在3D打印反應(yīng)堆芯內(nèi)嵌入的 β-半乳糖苷酶的催化下發(fā)生水解結論，產(chǎn)生半乳糖和ONP。其中質生產力，ONP的吸光度用于量化酶活性適應性強。c ）分光光度計(jì)測試結(jié)果表明，嵌入酶的3D打印反應(yīng)核心與不嵌入酶的3D打印反應(yīng)核心相比先進的解決方案，產(chǎn)品信號顯著拓展。具有代表性反應(yīng)核心部件參數(shù)為邊長為2 mm立方體，p=150 µm宣講活動，w=100 µm不斷進步，水平排列7 × 7 通道工藝技術。各測試三個樣本，p < 0.001規模。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差 (sem)近年來。




隨后，文章探討了不同打印結(jié)構(gòu)對反應(yīng)器性能的影響發展目標奮鬥。以無通道的立方體為參考樣本技術先進，結(jié)果表明隨著催化結(jié)構(gòu)的邊長增加，比活性和合成速率均降低延伸。這是因?yàn)榇呋诵某叽缭龃髸r健康發展，位于中心區(qū)域的酶與反應(yīng)物之間的擴(kuò)散路徑變長，導(dǎo)致酶的利用效率降低大數據，同時產(chǎn)物擴(kuò)散也受到阻礙長效機製。這表明傳統(tǒng)無通道反應(yīng)器在擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)的過程中，若不解決酶活性中心的可及性問題數字技術，增加體積會導(dǎo)致產(chǎn)量迅速達(dá)到瓶頸奮戰不懈。



基于上述現(xiàn)象，為進(jìn)一步改善反應(yīng)物擴(kuò)散和酶可及性問題措施，團(tuán)隊(duì)嘗試在反應(yīng)器核心中設(shè)計(jì)通道有所增加。初步固定通道寬度為24 μm，改變反應(yīng)器核心的壁厚度（24 μm - 480 μm）更高要求，觀察到壁厚從480 μm減小到24 μm時越來越重要的位置，比活性提高約40%優勢與挑戰，其中壁厚度小于100 μm 時提升尤為顯著深刻變革。而這一尺度是傳統(tǒng)3D打印難以實(shí)現(xiàn)的，再次證明PμSL技術(shù)運(yùn)用于該類結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)優(yōu)勢勞動精神。實(shí)驗(yàn)觀察到合成速率并未隨壁厚度減小而顯著增加效高，這是因?yàn)闇p小壁厚度雖縮短了擴(kuò)散路徑提高了合成速率前沿技術，但也減少了酶的總質(zhì)量，二者存在權(quán)衡關(guān)系性能。進(jìn)一步的研究表明多種方式，固定壁厚度為24 μm，改變通道寬度（24 μm- 96 μm）時技術創新，比活性增加15%深入交流研討，原因是較大通道利于熱對流，使底物更快到達(dá)水凝膠中心廣泛應用，從而增加了底物與酶的接觸機(jī)會關註度。然而，合成速率卻下降了43%，主要原因?yàn)橥ǖ莱叽缭龃髮?dǎo)致打印水凝膠體積減小敢於挑戰，進(jìn)而使得酶質(zhì)量隨之減少不斷創新。



綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了比活性提供了遵循，采用薄通道壁和大孔隙組合可使比活性提高60% 參與水平，但就會導(dǎo)致在流動條件下大孔隙重要性降低。而對于小型反應(yīng)器核心而言基石之一，較小孔隙和增加酶質(zhì)量更利于提高合成速率優化上下。此外，分析表明比活性和合成速率與宏觀表面積相關(guān)性較差模樣，高分辨率3D打印可精確控制分子在水凝膠中擴(kuò)散的最大路徑長度，進(jìn)而優(yōu)化生物催化反應(yīng)器性能服務。


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圖3. 通過改變通道尺寸和壁厚提高反應(yīng)器核心的效率很重要。a）增加3D打印立方體的尺寸導(dǎo)致比活度（b）和合成速率（c）均下降。水凝膠立方體的尺寸范圍為L=1.25至2.0 mm覆蓋，并含有嵌入的β -Gal異常狀況。d ）將通道間壁厚從w=480降低至24 μm，可使反應(yīng)器核心效率提高約50%高效，比活性變化結(jié)果如（e）所示應用創新，合成速率（f）在此范圍內(nèi)略有增加。立方體尺寸固定在L=2.0 mm機構，孔徑固定在24 μm的特性。g ）將通道寬度從p=24增加至96 μm，提升反應(yīng)器核心效率基礎，如比活性（h）的結(jié)果提供堅實支撐，但合成速率降低（i）。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差 (sem)高產，各重復(fù)三次信息化技術。



接下來，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并打印了一套完整的連續(xù)流反應(yīng)器良好。組裝完成后逐步顯現，研究人員先以50 μL/min 的流速將500 μL反應(yīng)物溶液注入反應(yīng)器，并重復(fù)9次循環(huán)引領。實(shí)驗(yàn)初期自動化裝置，由于反應(yīng)器需要時間建立穩(wěn)定的反應(yīng)物和產(chǎn)物流動狀態(tài)，輸出的比活性較低（0.16 μmol·min-1·mg-1）應用前景。但隨著循環(huán)次數(shù)的增加開展攻關合作，反應(yīng)器逐漸達(dá)到穩(wěn)態(tài)，比活性也逐漸升高，最終達(dá)到約0.8 μmol·min-1·mg-1并趨于穩(wěn)定的有效手段。

在比活性穩(wěn)定后統籌推進，文章進(jìn)一步探究流速對反應(yīng)器性能的影響〈蟠筇岣?？刂屏魉僭?25-1000 μL/min 范圍內(nèi)并保持500 µL的反應(yīng)物總量的必然要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明比活性隨著流速的增加而不斷提高。當(dāng)最高流速1000 μL/min時取得了一定進展，比活性達(dá)到 7.0 μmol·min-1·mg-1完善好，相比靜態(tài)實(shí)驗(yàn)中獲得的最高比活性提高了200% 以上，且有效因子達(dá)到64%積極參與。這一結(jié)果與前期文獻(xiàn)中使用的3D擠出法（<7%）和3D噴射法（21.2%）的結(jié)果相比問題分析，有顯著的提升。合成速率也呈現(xiàn)出隨流速增加而上升的趨勢交流研討。在流速為1 mL/min 時更加完善，合成速率，達(dá)到最大值0.29 μg·min-1·mm-3建設應用，相比靜態(tài)實(shí)驗(yàn)提高了240%支撐作用。綜上所述，在低轉(zhuǎn)化率下動力，比活性/合成速率與流速呈線性比例關(guān)系同時，由于底物在主體流動中的濃度相對穩(wěn)定，流速成為控制合成速率的關(guān)鍵因素效高性。但仍存在大量試劑未反應(yīng)就流過通道的問題模式。這也表明當(dāng)前反應(yīng)器在底物利用效率方面還有提升的空間。



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圖4. 3D打印的連續(xù)生物催化流動反應(yīng)器提升。a）流動反應(yīng)器裝置示意圖通過活化。使用注射泵可以實(shí)現(xiàn)可控流速將底物分子注入 3D 打印生物催化反應(yīng)器。溫度由設(shè)定值控制的水浴槽精確控制的特點。b）流動反應(yīng)器的放大示意圖健康發展，顯示了反應(yīng)器核心內(nèi)嵌入的反應(yīng)酶（β-半乳糖苷酶）。當(dāng)?shù)孜颫NPG流過反應(yīng)器核心時大數據，會得到產(chǎn)物半乳糖和 ONP長效機製。c）流動反應(yīng)器外殼的CAD文件，其中箭頭表示流動方向數字技術。d） CAD文件顯示了集成反應(yīng)器核心與反應(yīng)器外殼的結(jié)構(gòu)奮戰不懈。e） 3D打印產(chǎn)出的反應(yīng)器核心（PµSL）集成到3D打印反應(yīng)器外殼（AnyCubic）中。f） β-半乳糖苷酶的比活性在重復(fù)循環(huán)后起初表現(xiàn)出增加趨勢措施，然后開始走向平穩(wěn)取得顯著成效，其循環(huán)周期為兩小時新模式。g）1 次循環(huán)是 500 µL反應(yīng)溶液以 50 µL/min的速率注入。h）流速增加不容忽視，比活性和合成速率也增加組織了。



總結(jié)：該研究運(yùn)用高精度面投影微立體光刻 (PμSL) 3D 打印技術(shù)，打印高分辨率 (10 μm)說服力、高保真搶抓機遇、酶活性水凝膠反應(yīng)器核心。相較于無通道的3D打印部件表示，該結(jié)構(gòu)成功將比活性提升60%全面闡釋，在小于100 μm 尺度實(shí)現(xiàn)效率突破，證明高分辨率3D打印可優(yōu)化反應(yīng)器性能競爭力所在。同時引人註目，構(gòu)建的3D打印連續(xù)生物催化流動反應(yīng)器性能突出。在最高流速下合成速率相比靜態(tài)實(shí)驗(yàn)提升240%溝通機製，有效因子達(dá)64%好宣講。并且，小型反應(yīng)器理論的時空產(chǎn)率較好實現了超越，滿足商業(yè)高價(jià)值產(chǎn)品生產(chǎn)要求，若能放大規(guī)模去完善，有望推動藥物制造向更可持續(xù)的方向發(fā)展橋梁作用，為生物催化領(lǐng)域帶來新的突破。